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28次甘油三酯( TG) 含量检测试剂盒说明书
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:100T/96S 产品内容:
试剂一:自备,取玻璃空瓶,加入 60mL 正庚烷,60mL 异丙醇,盖紧后混匀,4℃保存。
试剂二:液体 3mL×1 瓶,4℃保存。试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂四:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存。试剂五:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。试剂六:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。
标准品:粉剂×1 瓶,临用前加 5mL 试剂一,即 1mg/mL 甘油三酯标准溶液,4℃保存。
产品说明:
TG 是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子,不仅是细胞膜的主要成分,也是重要呼吸底物。 测定原理: 用异丙醇抽提取 TG,KOH 皂化 TG 后水解生成甘油及脂肪酸,过碘酸氧化甘油生成甲醛, 在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色物质,在 420 nm 有特征吸收峰,其颜色的深浅与 TG 含量成正比。
自备仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96 孔板、水浴锅、可调式移液枪、双蒸水、125mL 玻璃空瓶。
操作步骤:
一、TG 的提取:
1、 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清待测。
2、 细胞、细菌:先收集 400-500 万细胞或细菌到离心管内,弃上清,加 1mL 试剂一,超声波破碎
1min(强度 20%,超声 2s,停 1s),8000g, 4℃离心 10min,取上清待测。
3、 血清(浆)等液体样品:直接测定。二、测定操作:
1.分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 420 nm,蒸馏水调零。
2.水浴锅预热到 65℃。
空白管标准管测定管
双蒸水(µL)40
标准液(µL)40
TG 待测液(µL)40
试剂一(µL)125125125
试剂二(µL)252525
加试剂一后充分混匀,再加试剂二,剧烈振荡 30s,静置,待分层后取上层溶液 15µL,置于新的 EP 管中。
3.甘油三酯含量测定:
空白管标准管测定管
上层溶液(µL)151515
试剂三 (µL)505050
试剂四(µL)151515
充分混匀,65℃水浴 3min
试剂五(µL)505050
试剂六(µL)505050
充分混匀,65℃水浴 15min
转移至微量比色皿/96 孔板测定 420nm 处吸光度,记为 A 空,A 标和 A 测。注意:空白管和标准管只需测定一次。
三、计算公式:
1.血清(浆)中甘油三酯含量:
TG 含量(mg/dL)=C 标准品×(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)
=(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)
C 标准品:1mg/mL;100:单位换算系数,1dL=100 mL。
2.组织中甘油三酯含量:
(1)按样本蛋白浓度计算
TG 含量(mg/ mg prot)= C 标准品×V×(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷(Cpr×V)
=(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷ Cpr
(2)按样本鲜重计算
TG 含量(mg/ g 鲜重)=C 标准品×V×(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷W
=(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷ W
C 标准品:1mg/mL ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;V:加入试剂一的体积,
1mL。
3.细胞、细菌中甘油三酯含量:
TG 含量(mg/104 cell)=C 标准品×(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷细菌或细胞密度
=(A 测-A 空)÷(A 标-A 空)÷细菌或细胞密度
C 标准品:1mg/mL;细菌或细胞密度:104 cell /mL。
注意事项:
1.试剂盒中有易挥发性物质,实验过程中需佩戴手套和口罩,试剂瓶盖打开后应该及时盖紧。
2.加试剂二后需剧烈震荡,使待测液中甘油三酯得到充分提取。
3.最低检出限为 100µ mol/L。
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