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蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS)试剂盒说明书微量法

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蔗糖合成酶(Sucrose synthaseSS)试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

蔗糖是源(叶片等)光合产物向"器官运输的主要形态。SSEC 2.4.1.13)催化植物体内游离果糖和葡萄糖合成蔗糖。

测定原理

SS催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖,蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰

试剂的组成和配制

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:液体 2mL×1 瓶,4℃保存

试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:液体 6mL×1 瓶,4℃保存;

样品测定的准备:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至480nm,蒸馏水调零。

2、样本测定,(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL)  

测定管  

对照管  

标准管  

空白管

样本  

10

10



蒸馏水  


45  

45  

55

试剂二



10


试剂一

45




混匀,25℃准确水浴 10min

试剂三  

15  

15  

15  

15

沸水浴中煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),冷却

试剂四  

210  

210  

210  

210

试剂五  

60  

60  

60  

60

混匀,沸水浴30min,冷却后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。

SS 活性计算

1、按照蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

SS 活性(μg/min/mg prot)= {C 标准管×V1×测定管-A 对照管标准管-A 空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×测定管-A 对照管标准管-A 空白管)÷Cpr

2、按照样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

SS 活性(μg/min/g 鲜重) = {C 标准管×V1×测定管-A 对照管标准管-A 空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×测定管-A 对照管标准管-A 空白管)÷W

标准管:标准管浓度,1000μg/mLV1:加入反应体系中样本体积,0.01mL; V2:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g:反应时间:10min

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