JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒

产品描述

线粒体膜电位（ΔΨm）降低是细胞早期凋亡的关键标志。这种膜电位的下降源于线粒体膜通透性的改变，主要由促凋亡蛋白（如 Bax 二聚体形成以及 Bid、Bak、Bad 的激活）诱导线粒体外膜形成孔隙所致。伴随这些蛋白的激活，细胞色素 C 会从线粒体释放到细胞质中。

JC-1 是一种广泛应用于检测 ΔΨm 的理想荧光探针，适用于细胞、组织或纯化线粒体样本。其检测原理基于膜电位依赖性的荧光状态转换：在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 为单体，可以产生绿色荧光。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降，同时也可以用 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1单体的最大激发波长为 510 nm，最大发射波长为527 nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为 585 nm，最大发射波长为 590 nm。这款试剂盒操作简单快速，可以通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪检测。

订购信息

产品组分

运输与保存

蓝冰运输。-20℃避光保存，有效期36个月。注：B组份也可以放4℃保存；为避免反复冻融，A与C组分建议分装。

光谱特性

Ex/Em：    510/527 nm（单体物，绿色）              585/590 nm（聚合物，红色）

使用方法

1.试剂准备：

使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续操作。

（1）配制 JC-1 工作液：按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液：先取10 µL 100×JC-1染色液，加入到890 µL灭菌的ddH₂O中，涡旋混匀，再向上述混合液中加入100 µL 10× Assay Buffer，涡旋混匀，即可得到1×JC-1染色液。

注：① 配置体积可同比例扩大或缩小。②JC-1(100× in DMSO)在较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以 20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。③工作液配置完成后，一定要及时孵育细胞，避免工作液产生沉淀。

（2）配制1× Assay Buffer：用 ddH₂O 按 9：1 稀释检测缓冲液（如1 mL 10×assay buffer + 9 mL ddH₂O）。

2. 染色

开始实验之前，请确保JC-1和CCCP溶液已恢复至室温。

(1)     按实验所需，在培养板中接种细胞（悬浮细胞不要超过10⁶个/mL）。

(2)     阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃ 孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3. 对于贴壁细胞（荧光显微镜或荧光酶标仪的检测流程）

（1）对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1 mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

（2）加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。

（3）孵育结束后，吸除上清，加入1 mL 预冷的1×Assay Buffer（4℃左右洗涤效果较好），吸除上清，重复一次。

（4）加入2 mL 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红，用荧光显微镜下观察，也可以用荧光酶标仪检测。

注：①如果希望采用流式细胞仪检测，染色前*行消化处理，将其制成细胞悬液，参考悬浮细胞的检测方法。

②JC-1 染色并洗涤完成后尽量在30 min 内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

4. 对于悬浮细胞（荧光显微镜和流式细胞仪检测流程）

（1）取5×10⁵ 个细胞，重悬于0.5 mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

（2）加入0.5 mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 min。

（3）孵育结束后，1000 rpm 离心5 min，弃上清（注意尽量不要吸除细胞）。

（4）加入1 mL 预冷的1×Assay Buffer 重悬细胞（4℃左右洗涤效果较好），1000 rpm 离心5 min，去除上清，重复一次。

（5）再用适量预冷的1×Assay Buffer 重悬，用荧光显微镜观察，也可以用流式细胞仪分析。

注：JC-1 染色并洗涤完成后尽量在30 min 内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

5. 纯化后的线粒体

(1)0.9 mL JC-1 染色工作液中加入0.1 mL 总蛋白量为10~100 μg 纯化的线粒体。

(2)用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan)，

(3)激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485 nm 时，可以在475~520 nm 范围内设置激发波长。

(4)用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。

6. 结果分析

(1)流式细胞仪分析

对于正常细胞，在PE 或PI(FL2)通道可以检测到线粒体内的JC-1 红色聚集物；对于凋亡细胞，在FITC(FL1)通道可以检测到JC-1 绿色单体物。

(2)荧光显微镜分析

1)采用可以同时检测荧光素和罗丹明，或者荧光素与Texas Red 的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。

2)对于正常细胞，拥有完整的线粒体膜电位，线粒体在590 nm 处发出红色荧光；对于凋亡或坏死的细胞，染料以单体形式存在，在530 nm处发出绿色荧光。

(3)荧光酶标仪分析

1)红色荧光：Ex/Em：550/600 nm；绿色荧光：Ex/Em：485/535 nm。

2)计算红绿荧光比值：与正常细胞相比，在凋亡或坏死细胞中，红绿荧光比值会降低。

注意事项

1.     本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.     荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

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