许多用于生物素化和交联的蛋白质修饰试剂涉及通过伯胺。伯胺存在于所有蛋白质和肽中，因为它们构成N末端，也是赖氨酸残基侧链。胺，赖氨酸ε-胺和N-末端α-胺，是蛋白质分子中丰富的基团并且代表了生物素化最常见的靶标。例如，BSA含有59种伯胺，其中多达35种是可在分子表面获得，并可与胺反应性酯反应.

广泛使用的胺反应性生物素化和交联试剂是水不溶性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯或水溶性N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）酯。

在磺基NHS酯的N-羟基琥珀酰亚胺环上添加带电荷的磺酸盐（SO3-）导致它们在水（~10mM），但对质膜不渗透。质膜的溶解性和不渗透性使得它们是研究细胞表面蛋白质的理想选择，因为它们只会与血浆外表面的蛋白质分子反应膜。

两种形式的NHS酯在水溶液中快速水解（在pH7下7小时，在pH9下分钟）

NHS酯类必须妥善处理和储存。NHS酯应干燥储存，并允许加热至打开前的环境温度，以避免冷凝。话虽如此，反复打开和关闭是不恰当的处理将导致湿气的引入和NHS酯的水解。水解（和结合）导致NHS的释放，可以通过以下程序进行分析。

方法

所需材料

•NHS酯试剂

•DMSO（类别#BKC-17）或DMF（类别#BK C-16）用于溶解NHS酯

•pH7-8的无胺缓冲液。我们建议使用磷酸盐缓冲液，但应避免使用Tris和甘氨酸缓冲液

•0.5-1.0氢氧化钠

•石英试管

•分光光度计设置在260-280nm

程序

1.将1-2mg NHS酯试剂溶于2ml无胺缓冲液中。准备一个含有2ml无胺缓冲液的对照管。

注：如果使用非水溶性试剂；先溶于0.25ml DMSO或DMF中，然后加入2ml无胺缓冲液。以类似方式制备对照管（0.25ml DMSO或DMF和2ml无胺缓冲液）

2.立即使用对照管将设置在260nm的分光光度计归零，然后测量NHSester管的吸光度。

注：如果吸光度>1.0，用无胺缓冲液稀释整个溶液，直到读数<1.0。

3.将100µl 0.5-1.0N NaOH添加到1ml来自步骤2的NHS酯中。涡旋30秒

4.立即（1分钟内）测量碱性水解试剂的吸光度。

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