1.有机溶剂的等级

应选用HPLC级的有机溶剂。

2.溶剂前处理

过滤

过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。

滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。

醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。

尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。

脱气

脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：

（1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

（2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

（3）检测器中的气泡产生基线波动

脱气方法：

1、超声脱气

2、减压脱气

3、在线脱气

3、样品前处理

（1）使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中，

尤其在柱中产生沉淀

（2）进样前使用0.45um 的滤膜进行过滤，

如果样品很脏，要使用0.22um的滤膜进行过滤。

（3）对于含有复杂基质的样品，前处理后再进样。

4、进样

（1）进样器

•自动进样器

•手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入

（2）手动进样器的原理图

•部分注入：一般要求进样量zui多为定量环体积的一半，如20μl的定量环zui多进样10μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同。

•全量注入：进样量zui少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环zui少进样60至100μl的样品，这样才能*置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。

5、洗脱

（1）等度洗脱

（2）梯度洗脱

使用梯度洗脱的原因：

梯度洗脱要点：

梯度洗脱：

优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低zui小检测量和提高分离精度

注意事项：

（1）溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差。

（2）梯度混合的溶剂互溶性要好。

（3）梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如

紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变

化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。

（4）查看空白实验的数据。

（5）遵守分析周期（zui初的分析数据不采用）。

6、色谱柱的类型及适用范围