22rv1-LUC人前列腺癌荧光素酶标记细胞 培养步骤

产品A名称：22rv1-LUC人前列腺癌荧光素酶标记细胞 培养步骤已通过STR鉴定

中文名称：22rv1-LUC人前列腺癌荧光素酶标记细胞 

规格：T25

形态特征：

生长状态：成纤维细胞样

特征特性：贴壁生长

培养条件：DMEM(高糖）+10%FBS（推荐BI优等胎牛血清货号：04-001-1acs）

传代方法：消化3-5分钟。1:2。3天内可长满。

冻存条件无血清冻存液规格：100ML

支原体检测：阴性

使用权限：A类

参考文献：

供应商：上海琛艺实业有限公司

复苏周期：10个工作日左右

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL*培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，*脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

· 细胞名称： 22rv1-LUC人前列腺癌荧光素酶标记细胞 培养步骤已通过STR鉴定

· 组织  小鼠乳腺癌细胞系

· 母细胞来源  客户

· 转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选 

1. 质粒部分

1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。

2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳，TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。

3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。

4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。

5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。

6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。

7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。

8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。

9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。

1. 慢病毒包装部分

1. 质粒共转染细胞：转染前一天，293T在10cm培养盘中的细胞达到90％，胰酶消化后，1：3传入新10cm培养盘中。转染时，细胞在培养盘中密度达到80％。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。

2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。

3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。

1. 慢病毒感染&筛选

1.感染前一天(Day1)，消化4T1细胞并计数，将细胞铺于24孔板中（以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度，37°C过夜孵化细胞。

2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。

3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl*培养基。

5.(Day4)换液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

维持培养。

7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。

8. 4T1-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×10⁴细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。