产品推荐:气相|液相|光谱|质谱|电化学|元素分析|水分测定仪|样品前处理|试验机|培养箱


Ky开元集团>技术中心>操作使用>正文

欢迎联系我

有什么可以帮您? 在线咨询

KYSE450细胞|人食管癌细胞GFP绿色标记细胞 含STR鉴定

来源:上海琛艺实业有限公司   2020年07月12日 10:58  

KYSE450细胞|人食管癌细胞GFP绿色标记细胞 含STR鉴定

规格:T25

形态特征:

生长状态:成纤维细胞样

特征特性:贴壁生长

培养条件:DMEM(高糖)+10%FBS(推荐BI优等胎牛血清货号:04-001-1acs

传代方法:消化3-5分钟。1:2。3天内可长满。

冻存条件无血清冻存液规格:100ML

支原体检测:阴性

使用权限:A类

参考文献:

供应商:上海琛艺实业有限公司

复苏周期:10个工作日左右

培养步骤:

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL*培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

 

1、对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:

1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞,*脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

PS:若客户收到2ml小管细胞,收到细胞后,用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内,严格无菌操作;将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿,加入5ml左右*培养基混匀,放入培养箱过夜培养后查看细胞密度:若密度未超过80%,换液继续培养,视情况传代或者冻存。若密度超过80%,可直接进行传代(方法同上)。

2、对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:

方法一:收集细胞,1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二:可选择半数换液方式,弃去半数培养基后,将剩余细胞悬起,将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

 

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,进行离心收集,1000RPM条件下离心8-10分钟,去除上清,按冻存数量加入血清及DMSO,冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

 

PS:若客户收到2ml小管细胞,收到细胞后,用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内,严格无菌操作;将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿,加入5ml左右*培养基混匀,放入培养箱过夜培养后查看细胞密度:若密度未超过80%,换液继续培养,视情况传代或者冻存。若密度超过80%,可直接进行传代(方法同上)。

 

上海琛艺是一家专业从事细胞培养相关产品的公司,拥有独立细胞房(可随时约定参观),供应胎牛血清,STR鉴定细胞,感受态细胞等,专业,专注,性价比高,是您Shou选之家。

1. 如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,选择MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。KYSE450-GFP 细胞

2. 何时须更换培养基?

视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

KYSE450-GFP 细胞3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

KYSE450细胞|人食管癌细胞GFP绿色标记细胞 含STR鉴定

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

KYSE450-GFP 细胞8. 细胞之接种密度为何?

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。KYSE450-GFP 细胞

9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可,若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。

KYSE450-GFP 细胞10.冷冻管应如何解冻?

取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

KYSE450-GFP 细胞12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。1次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低,并可减少污染之机会。

13.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

14. 细胞冷冻培养基之成份为何?

动物细胞冷冻保存时使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况, 1次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

KYSE450-GFP 细胞16.冷冻保存细胞之方法?

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

18.培养基中是否须添加抗生素?

除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。

KYSE450-GFP 细胞19.应如何避免细胞污染?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法。

20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

原则上:直接灭菌后丢弃之。

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。

KYSE450-GFP 细胞21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?

不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响?

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?

直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

KYSE450-GFP 细胞25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?

培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。

26. 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

27. 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

KYSE450-GFP 细胞29. 收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?

免责声明

  • 凡本网注明“来源:Ky开元集团”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-Ky开元集团合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:Ky开元集团”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其他来源(非Ky开元集团)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
企业未开通此功能
详询客服 : 0571-87858618