链格孢霉的生物合成与产毒培养及检测方法！

一、菌种简介

链格孢霉菌属于丝状真菌, 是一种普遍存在于环境中的病原体和腐生菌, 是低温环境下导致水果、蔬菜等农产品腐烂变质的主要微生物。

链格孢霉菌产生的多种次级代谢产物对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性等慢性或急性毒性作用。

链格孢霉与曲霉、青霉和镰刀菌一样,也是一种重要的产毒菌。链格孢霉能产生多种代谢物,其中至少有10种代谢物对动物和植物具有毒性。从食物中检出的有链格孢酚(alternariol,AOH)、链格孢酚甲基(alternariolmethyl ether,AME)、细交链孢菌酮酸(tenuzonic acid,TeA)、链格孢霉素(altenuene,ALT)、细格菌毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(altertoxinⅠ、Ⅱ、Ⅲ, ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ)和AAL毒素(AAL toxins)。

二、基本信息

中文名：链格孢霉菌

外文名：Alternaria

代谢产物：链格孢霉毒素

毒性：诱变性、致癌性和致畸性

来源：土壤， 空气

毒素种类：5种类型

三、分布及类型

链格孢霉的不育菌丝匍匐，分隔，分生孢子梗单生或成簇。大多数不分枝，较短，与营养菌丝几乎无区别。分生孢子倒棒状，顶端延长成喙状，淡褐色，有壁砖状分隔，暗褐色，常数个成链，有人称这种分生孢子为同节孢子。该属菌是土壤，空气中常见的腐生菌。

链格孢霉分布广泛,其有毒代谢产物污染农作物的情况相当普遍，但是由于人们平均每日的摄入量很低,未能引起足够重视。虽然食用含小量毒素的食品不会引起急性中毒，但是长期食用有可能引起慢性中毒。从食物里能同时检出两种甚至两种以上的链格孢霉毒素。越来越多的证据表明这些毒素有协同作用，有必要进一步研究这些毒素的协同作用以及在食物及饲料里的发生率及稳定性。

根据链格孢霉毒素化学结构的不同,可以将其分为 5 种不同的类型:

(1)二苯并吡喃酮类，又称为聚酮，代表性毒素有 AOH、AME、链格孢霉素(alternaria, ALT)；

(2)四氨基酸衍生物类: TeA 和异细交链孢菌酮酸(iso-TeA)；

(3)苝醌类，包括交链孢毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ和 ATX-Ⅲ)和匍柄霉毒素Ⅲ；

(4)一系列长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类化合物, 即 AAL毒素。AAL 毒素又分成 2 种不同的类型, AAL-TA 和AAL-TB。AAL-TA 包括 1,2,3-丙烷三羧酸和 1-氨基-11,15-二甲基十七-2,4,5,13,14-五醇的 2 种酯类(C13 或 C14)。AAL-TB 包含 1,2,3-丙烷三羧酸和 1-氨基-11,15-二甲基十七-2,4,13,14-呋喃的 C13 或 C14 位 2 种酯类。

(5)混杂结构，如腾毒素(tentoxin, TEN)， 一种环形四肽。研究比较多的 3 种主要的链格孢霉毒素为: AOH、AME 和 TeA。

四、生态学及污染

链格孢霉对农产品侵染范围很广，随各地区的温度、湿度、通风和日照以及产毒菌株等情况的不同而不同。从美国、澳大利亚、巴基斯坦、阿根廷、印度、西班牙和英国等地的高粱、玉米、小麦、油菜籽、葵花籽、芥子、苹果和番茄中均分离到数种链格孢霉，并检出链格孢霉毒素。

五、毒性作用

链格孢霉对动植物的毒性作用早已有许多报道。第二次世界大战期间曾发生发霉谷物引起的中毒事件，从人们食用的发霉谷物里分离出多种链格孢霉。用从烟草里分离出的Alternaria longipes的产毒培养物喂饲雏鸡,结果出现食欲不振、昏睡、腹泻、肌无力和昏迷， 4～8d出现死亡， 33%的培养物使雏鸡死亡， 13%导致发育严重迟缓。病理检查表明有前胃出血，胗糜烂。

链格孢霉毒素大体上可以分为4类。它们对哺乳动物、细菌细胞和小鼠有不同程度的毒性作用，总的来说TeA、ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ和ATX-Ⅲ比AOH和AME毒性要大得多。

六、产毒培养

链格孢霉所产毒素很多，因此产毒的条件变化也很大。但各种毒素共有的产毒有利条件是温度在20℃，相对潮湿的环境。避光对产AOH和AME有利，蓝光和白光在生长初期抑制AOH和AME的产生。M ass等比较了多种链格孢霉在液体和固体培养基上产AOH和AME的情况。

所有5种不同链格孢霉的14株分离菌株均产AOH和AME，但是产毒量随菌株的不同和培养基的不同变化很大。在所试验的3种液体培养基药物介质肉汤(PH)、酵母膏蔗糖肉汤(YES)改良察氏培养基(MCD)中，AOH和AME的产量在MCD上。在这些菌株中，产毒量的是一株A.tenuis，在300g稻米培养基上25℃避光培养14天，AOH和AME的产量分别高达16mg和125mg。合成培养基因为介质简单，容易纯化等优点，适合放射标记毒素的生产，以便于进一步研究毒素在动物体内的代谢。

七、检测方法

检测链格孢霉毒素的方法有很多,如薄层色谱法(TLC)、气-液色谱法(GLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)。1984年以前主要是用TLC法,多数已被HPLC法取代。

链格孢霉毒素常规的检测方法主要有 GC-MS、HPLC-MS 等技术，但是这些大型的检测设备只能满足实验室中检测的需求，不能满足当前社会所追求的实时、快速、便携式检测的需求。因此，迫切需要建立相关的快速检测方法，如微流控芯片、免疫生物传感器技术、分子印迹技术等；或是开发一些相关的快速检测试剂，如 ELISA 试剂盒、试纸条等。这些快检方法至今没有在链格孢霉毒素检测中得到广泛应用，原因主要是: 绝大多数方法的建立都需要使用链格孢霉毒素的抗体。因此,筛选得到高专一性、亲和性的单克隆抗体是广泛应用这些快速检测方法的最重要的前提。另外，由于核酸适配体(aptamer)的专一性和亲和性都已经可以和抗体相媲美，因此，除了抗体之外，还可以对链格孢霉毒素的aptamer进行筛选，建立基于 aptamer 的快速检测方法。

以上这些快速检测方法的建立以及快速检测试剂的开发，不仅可以缩短分析时间，减少样品的消耗量，同时还可以实现多种毒素的实时、便携式、连续检测， 这对水果、蔬菜等农产品中链格孢霉毒素的检测具有重大意义，也必定是未来的研究重点和发展趋势，因此需要科学家们投入更多的时间和精力开发相关的快速检测试剂以及建立相关的快速检测方法用于链格孢霉毒素的检测。可以预见，传统的链格孢霉毒素检测技术将逐渐被各种新型、便携式、实时、快速的检测技术所取代。

八、生物合成

AOH和AME以及其它二苯并吡喃酮衍生物属于聚酮化合物(polyketide)。聚酮化合物通常是真菌毒素的前体,与真菌脂肪酸的形成机制相似。大家所接受的这类化合物的形成途径是一个乙酰辅酶A和六个丙二酰辅酶A通过头尾醛醇缩合反应(这个缩合过程没有氧原子及其它原子的丢失)，首先形成芳香环(即形成AOH)。AOH是大多数二苯并吡喃酮衍生物的形成前体。S-腺苷甲氨硫酸与AOH反应生成AME。AME在一定条件下发生蒽醌重排，降解产物就是其它二苯并吡喃酮衍生物。TeA形成是一单位的氨基酸(L-异亮氨酸、L-色基酸或L-缬基酸)和二单位的乙酸缩合形成四氨基酸环，但其形成机制还未探明。

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