心脏血管化类器官（cVOs）和肝脏血管化类器官（hVOs）的培养步骤，包括细胞准备、微图案化、分化诱导、生长因子和小分子的添加以及后续的培养和分析。

第一，心脏血管化类器官（cVOs）培养步骤

1. 细胞准备

- 使用人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（hiPSCs）。

- 维持hPSCs在Essential 8（E8）培养基中，每3-4天传代一次。

2. 微图案化

- 使用硅胶模具（stencil）在多孔板中创建2-6毫米直径的圆形hPSC单层微图案。

- 将模具放置在孔板中，用Matrigel（1:100稀释）覆盖模具，凝固后移除模具，留下微图案化的hPSCs。

3. 分化诱导

- 第0天：添加4或5 μM CHIR（GSK3β抑制剂）和5 ng/ml FGF2。

- 第3天：添加5 μM IWR（Wnt信号通路抑制剂）。

- 第5天：开始添加血管诱导因子，包括50 ng/ml VEGF（血管内皮生长因子）。

- 第7天：继续添加5 ng/ml FGF2、10 μM SB（TGF-β信号通路抑制剂）、50 ng/ml ANG2（血管生成素2）。

- 第9天：添加50 ng/ml ANG1（血管生成素1）。

- 第11天：继续添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB（血小板衍生生长因子）。

- 第13天：添加2 ng/ml TGF-β1（转化生长因子β1）。

- 第15天：继续添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB、2 ng/ml TGF-β1。

4. 培养和分析

- 在分化过程中，使用时间序列成像技术（如Incucyte S3）监测细胞的形态变化。

- 使用共聚焦显微镜进行高分辨率成像，以观察细胞类型和血管结构。

- 通过单细胞转录组学（scRNA-seq）分析细胞类型和基因表达。

- 进行电生理学（如多电极阵列MEA和电极记录）和钙成像分析，以评估cVOs的功能特性。

第二， 肝脏血管化类器官（hVOs）培养步骤

1. 细胞准备：使用与cVOs相同的hPSCs。

2. 微图案化：同样使用硅胶模具在多孔板中创建2毫米直径的圆形hPSC单层微图案。

3. 分化诱导

- 第0天：添加100 ng/ml Activin-A、10 ng/ml BMP-4、3 μM CHIR、100 ng/ml FGF2和10 μM LY294002（PI3K-AKT抑制剂）。

- 第3天：添加50 ng/ml FGF-10。

- 第6天：添加10 ng/ml FGF10和10 ng/ml BMP-4。

- 第3天或第6天：开始添加血管诱导因子，包括50 ng/ml VEGF、5 ng/ml FGF2、10 μM SB、50 ng/ml ANG2、50 ng/ml ANG1。

- 第7天至第20天：继续添加上述血管诱导因子，并根据需要调整生长因子和小分子的浓度。

4. 培养和分析

- 使用与cVOs相同的成像技术和分析方法来观察hVOs的形态和功能。

- 通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像，确认肝脏细胞（HCs）、内皮细胞（ECs）和平滑肌细胞（SMCs）的存在和整合。

- 通过单细胞转录组学分析hVOs的细胞类型和基因表达。

通过这些详细的步骤，研究人员成功地在体外模拟了人类心脏和肝脏的早期血管化过程，为研究心血管和肝脏疾病提供了新的模型和工具。

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