C/EBPβ 肽拮抗剂 Lucicebtide 诱导巨噬细胞促炎极化增强抗肿瘤免疫

The C/EBPβ antagonist peptide lucicebtide (ST101) induces macrophage polarization toward a pro-inflammatory phenotype and enhances anti-tumor immune responses

Keywords: C/EBPβ; M2-type macrophage; ST101; anti-pd 1 immunotherapy; lucicebtide; tumor associate macrophages (TAM).

免疫检查点抑制剂（ICI）已取得巨大的临床成功，但其疗效仅限于一小部分患者。由于免疫排斥是 ICI 治疗成功的主要障碍，因此靶向免疫抑制性肿瘤微环境（TME）已被确定为针对治疗反应不佳的很有希望的的联合策略。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是免疫抑制性 TME 的主要参与者。研究已经描述了巨噬细胞转录程序的 M1/M2 分型，即从免疫促进的“M1 型”到免疫抑制的“M2 型”。尽管已报道肿瘤类型之间的差异，但 TAMs 主要与 M2 型程序相关。因此，旨在将 TAMs 重编程为 M1 型程序的疗法预计会使顽固性肿瘤对免疫疗法敏感。

CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPβ）是一种转录因子，在调节肿瘤细胞生长、增殖和代谢转换中起直接作用。此外，C/EBPβ 促进与 M2 型表型相关的单核细胞中的转录程序。研究表明，C/EBPβ 活性的抑制可能会使巨噬细胞从 M2免疫抑制表型重新极化，并在因免疫抑制 TME 而对免疫治疗耐药的肿瘤中产生临床益处。Lucicebtide（以前称为 ST101）是 C/EBPβ 的肽拮抗剂。Lucicebtide 破坏 C/EBPβ 二聚化，从而增强其蛋白酶体降解，导致 C/EBPβ靶基因表达显著减弱。在几种临床前模型中，Lucicebtide 暴露在体外和体内均具有直接的抗癌活性。

基于此，美国 Sapience Therapeutics 研究中心在一项实验中探讨了体内lucicebtide对C/EBPβ的药理拮抗作用对人外周血单核细胞（hPBMC）来源的巨噬细胞培养物和同基因小鼠肿瘤模型中TAMs的影响。实验数据确定了 lucicebtide 是 TME 的新型免疫调节剂，具有克服 ICIs 耐药性或增强其抗肿瘤活性的潜力。研究成果发表于 Frontiers in Immunology 期刊题为“The C/EBPβ antagonist peptide lucicebtide (ST101) induces macrophage polarization toward a pro-inflammatory phenotype and enhances anti-tumor immune responses”。

首先，为了研究 C/EBPβ 拮抗作用对巨噬细胞极化的影响，建立了健康人类供体外周血的巨噬细胞培养物，并在lucicebtide 浓度增加的情况下诱导其向 M1 型（称为“M1”）或 M2 型（称为“M2”）表型的分化和激活（图1 A），用 LPS + IFN-γ（M1）或 IL-4（M2）激活巨噬细胞。通过流式细胞术分析表面标志物，M1 细胞表达 CD68^high CD163^low，M2细胞表达 CD68^low CD163^high （图1 B）。此外，lucicebtide以剂量依赖性方式增加了刺激到 M2 表型的巨噬细胞培养物中的 M1：M2 比率，在最高浓度下相对比率增加了 40 倍（图1 C、D）。值得注意的是，尽管 CD80高表达，但 lucicebtide暴露导致 M1 表型刺激的巨噬细胞中 CD80 中位荧光强度（MFI）呈剂量依赖性增加，表明lucicebtide进一步增强了 M1 细胞中的 M1 程序（图1 E）。相反，在 M2 群体中，与未处理的 M2 培养物相比，M2标记物CD200R以剂量依赖的方式下调（图1 F）。重要的是，在 lucicebtide暴露后，M1 或 M2 培养物中未观察到总活细胞数的显著减少。这些数据支持，在M2细胞定型和激活期间持续暴露时lucicebtide促进M1程序的能力。巨噬细胞极化是一个可塑性事件，C/EBPβ 活性是建立和维持 M2 程序所必需的，用lucicebtide 拮抗 C/EBPβ  既可以在 M2 条件下指示 M1 程序，也可以将免疫抑制的 M2 巨噬细胞转化为免疫活性的 M1 程序。

然后，研究了lucicebtide 对 C/EBPβ 靶基因和 M2 程序的影响，无监督聚类（UC）鉴定出 45 个基因标记，特别是 TAM 生物学中涉及的几种 M2 标志物或因子，包括 ALDH1A2、CD93、FOLR2、MARCO 和趋化因子 CCL17、CCL24、CCL13 和 CCL17。差异表达分析显示共有 414 个 DEGs 基因，其中 248 个在lucicebtide暴露后下调，166 个上调。在lucicebtide处理的 M2 细胞中ID2、BIRC3、CyclinA2 和 CDK1 显著下调。GSEA 分析的 RNAseq 数据集确定了细胞因子/趋化因子和 NF-kB 信号通路的显著下调以及与类固醇合成激活有关的基因的增加。这说明，lucicebtide 抑制 C/EBPβ 靶基因和 M2 程序。

图1      Lucicebtide 在人 PBMCs 来源的巨噬细胞培养物中将 M2 程序转变为 M1。

在体外与 M2 巨噬细胞共培养后，T 细胞增殖和活化受到抑制。因此，接下来研究了lucicebtide介导的 M2 到 M1 转化是否会在体外增强 CD8+ T 细胞活化，将 M2 或 M1 细胞暴露于 5 或 10 μM lucicebtide或对照，并与 CD8+ T 细胞共培养。正如预期，IFN-γ+ T 细胞与免疫抑制性 M2 巨噬细胞共培养的频率比与 M1 巨噬细胞共培养的频率低五倍（图2 A、B）。Lucicebtide 诱导 M2 共培养物或 M1 共培养物中 IFN-γ+ 成分细胞频率的剂量依赖性增加（图2 A、B）。值得注意的是，10 μM lucicebtide将 M2 共培养物中 IFN-γ+ 细胞的频率恢复到 M1 共培养物中观察到的 67%。这些结果表明，在 M2 巨噬细胞存在下，lucicebtide暴露足以恢复 T 细胞活性，并且可以进一步增强免疫活性条件下的 T 细胞反应。

为了研究 C/EBPβ 驱动的免疫抑制程序在人类癌症中的相关性，评估了 C/EBPβ 特征是否与乳腺癌（BC）患者的预后相关。结果证明了C/EBPβ 特征的表达与 HR 阴性 BC 和HR 阳性 BC 中的生存率均呈负相关，数据支持 BC 中 C/EBPβ 依赖程序的预后价值，并确定了在富含 TAM 的癌症中lucicebtide重编程免疫抑制性 TME 的可能性。

为了研究lucicebtide对 TAM 群体和免疫介导的抗肿瘤反应的影响，使用 4T1 TNBC 原位模型，评估lucicebtide在每周 3 次给药 10、25 或 50 mg/kg 后的抗肿瘤活性，结果分别导致 45.6%、73.8% 和 95.4% 的肿瘤生长抑制（TGI）。与对照组相比，lucicebtide 诱导的肿瘤体积减少了 41%，M1/M2 比率增加了 5.5 倍。该数据表明，lucicebtide促进免疫抑制性 TAMs 向免疫活性 M1 程序的复极化，并在体内 M1 巨噬细胞中富集。

通过研究其他癌症类型中 C/EBPβ与巨噬细胞浸润之间的关系，证明了C/EBPβ 表达与人肿瘤中巨噬细胞的浸润呈正相关。因此，可能需要更好地表征 M1 和 M2 特征，以了解 C/EBPβ 表达对这些群体的特定影响。

图2   lucicebtide介导的 M2 到 M1 的转化导致 T 细胞活化增强。

为了研究巨噬细胞lucicebtide复极化对抗肿瘤反应的影响，在 4T1 TNBC 模型中进行了联合 ICI 治疗的研究，用抗-PD-1（12.5 mg/kg，每周一次）、lucicebtide（25mg/kg，3 次/周）或两种药物联合给药处理小鼠（图3 A）。在第 42 天，单药lucicebtide诱导 64.2% TGI，抗 PD-1 诱导 20.3% TGI，联合给药组显示 70.0% 的 TGI。为了评估lucicebtide在不影响其直接抗肿瘤活性的情况下对免疫调节活性的影响，通过 sub-pharmacologic疗法用lucicebtide（10 mg/kg，3 次/周）、抗 PD-1（12.5 mg/kg，每周一次）或两种药物联合处理小鼠（图3 B）。在这种情况下，联合给药显示出更大的肿瘤生长抑制（85.8% TGI vs抗 PD-1：48.1% TGI；lucicebtide：42.5% TGI）和显著增强的活性（图3 B）。这些结果支持，Lucicebtide 增强抗 PD-1 疗法的抗肿瘤活性。

最后，实验试图确定对抗 PD-1 治疗无反应的肿瘤中的lucicebtide活性。由于在亲本 4T1 肿瘤中观察到部分反应（图3 B），通过二次移植获得对抗 PD-1 治疗无反应的 4T1 肿瘤（4T1R）难治性细胞系。与这些显示抗-PD1 耐药性的细胞一致，4T1R 肿瘤对抗 PD-1 治疗没有显示出统计学意义的反应（图3 C）。相反，25 mg/kg lucicebtide有效抑制 4T1R 肿瘤，抗 PD-1 和lucicebtide的组合导致 78.7% 的 TGI。重要的是，与单药反应相比，该联合疗法显著抑制了肿瘤生长（图3 C），表明与lucicebtide联合使用可以克服对抗 PD-1 治疗的耐药性。

此外，为了证明lucicebtide对 TAMs 影响对整体肿瘤反应的相关性，用抗 CSFR-1 抗体处理小鼠以耗尽其巨噬细胞群。单独的抗-CSFR1 对对照动物的肿瘤生长没有实质性影响 （图3 D），抗-PD1 或 lucicebtide 单药治疗也没有。虽然lucicebtide和抗 PD-1 联合治疗导致 74.2% 的 TGI，但抗-CSFR1 的给药将联合组的 TGI 降低至 38.7%（图3 D）。这些数据支持，lucicebtide对巨噬细胞的影响是其抗肿瘤反应的关键组成部分。

图3    Lucicebtide 增强抗-PD-1 的抗肿瘤活性。

总之，该研究表明，lucicebtide暴露会促进免疫抑制性 M2 巨噬细胞的丢失，同时促炎性 M1 巨噬细胞的增加。巨噬细胞极化被证明是一种可塑性事件，因为致力于 M2 程序的细胞仍然容易受到lucicebtide介导的复极化的影响。在以高 TAM 含量为特征的抗 PD-1 难治性同基因肿瘤模型中，巨噬细胞对 M1 表型的极化在体内得到证实，导致强大的抗肿瘤反应，并在联合抗 PD-1 检查点抑制的情况下增强。随后在巨噬细胞药理学耗尽的小鼠中进行的实验证实了巨噬细胞极化在 lucicebtide 介导的体内抗肿瘤反应中的作用。重要的是，lucicebtide对巨噬细胞极化的影响可能与它在 C/EBPβ 驱动的癌症中的直接细胞毒性协同作用。这些数据支持在临床环境中评估lucicebtide介导的 C/EBPβ 拮抗作用作为免疫调节剂，以增强免疫疗法（如检查点抑制剂）的抗肿瘤活性。

参考文献：Scuoppo C, Ramirez R, Leong SF, Koester M, Mattes ZF, Mendelson K, Diehl J, Abbate F, Gallagher E, Ghamsari L, Vainstein-Haras A, Merutka G, Kappel BJ, Rotolo JA. The C/EBPβ antagonist peptide lucicebtide (ST101) induces macrophage polarization toward a pro-inflammatory phenotype and enhances anti-tumor immune responses. Front Immunol. 2025 Mar 4;16:1522699. doi: 10.3389/fimmu.2025.1522699. PMID: 40103809; PMCID: PMC11913834.

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