从手动到自动：Countess细胞计数仪与血球计数板的性能比较-赛默飞

在细胞生物学研究中，细胞计数是一项基础但至关重要的实验步骤，直接影响实验的可重复性和准确性。传统的血球计数板（Hemocytometer）长期以来是实验室的标准工具，但随着技术的发展，自动细胞计数仪逐渐成为更高效、更准确的选择。本文将对两种方法进行详细对比，以便实验者有更清晰的了解。

血球计数板的计数方法与操作

1. 血球计数板的结构

血球计数板（Hemocytometer）是一种特制载玻片，通过精密蚀刻的网格系统实现细胞的手动计数和浓度计算。计数区由 9个1mm×1mm大方格 组成，四角的大方格分成16个中型方格，中央大方格分成400个小格（一般是16个中格 x 25个小格）。计数室深度固定为 0.1mm，因此每个大方格的体积为 0.1μL或者0.1mm³（1mm×1mm×0.1mm）。

2. 细胞分布假设

通过统计特定区域内的细胞数量，推算整体浓度（细胞数/mL）。基于泊松分布原理，要求细胞均匀分布且无聚集。如遇成团细胞，或者有细胞碎片，可能会影响到计数结果。

3. 操作步骤

? 样本制备：将细胞悬液稀释至合适浓度（通常 10?–10? cells/mL）。

? 加样：取 10 µL 细胞悬液（如需染色，混合10μL细胞悬液 + 10μL台盼蓝）柔吹打或倒置混匀。用移液器将 10μL 混合液滴加至计数板盖玻片边缘，依靠毛细作用填充计数室。液体应自然铺满计数区，无气泡（否则需重做）。

? 显微镜观察：一般在 10× 或 20× 物镜下观察，计数中央大方格内四角4个中方格的细胞数量。为了防止相邻的方格间重复统计，压在方格线上的细胞遵循记上不记下，记左不记右的原则。

? 计算浓度：                                       

以16个中格x 25个小格为例，四角的4个中格中一共有4x25 个（100个）小格。

每小格细胞均数=100格细胞总数 ÷ 100

细胞浓度（cell/mL）=小方格中细胞平均数x400 x 10 x 1000 x 稀释倍数

其中：

中央大方格的细胞数=小方格细胞平均数x400 （0.1mm³）

x 10 转换为 1mm³ 中的细胞数

x 1000 转换为 1cm³（1mL）中的细胞数

血球计数板的计算公式本质
将局部计数换算到 1 mL 体积，核心在于：

1. 数清细胞数 × 稀释倍数。

2. 除以实际计数的体积（通过选定方格区域和方格数）。

血球计数板的局限性

1. 主观性强：依赖操作者的经验，不同实验者可能得出不同结果。比如如果细胞较大，有的实验者可能依然使用中央大方格，有的实验者可能或选择四角的4个大方格；压线细胞的计数和成团细胞的计数也可能因人而异。

2. 耗时：每个样本需 3–5 分钟，重复计数更费时。

3. 误差大：

· 细胞分布不均导致计数偏差。

· 成团细胞难以准确分辨。

· 活/死细胞判断依赖台盼蓝染色，显微镜下颜色差异不大，不容易区分，易受主观影响。

随着成像技术的进步，细胞计数已实现自动化，从而在更短的时间和更少的努力下提供更高的准确性和可靠性。。

Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪与血球计数板的细胞计数对比

细胞计数准确性
主观性导致的变异性
无论采用何种细胞计数方法，依赖操作员的判断都会导致结果误差。显微镜和某些自动细胞计数仪的光强度和焦距设置具有主观性，可能导致结果不一致。操作员还需决定哪些对象应纳入或排除在细胞计数中。如果测量细胞活性，操作员还需判断哪些细胞应计为死细胞或活细胞。手动计数中的这些主观变量可能导致不同操作员之间的结果差异较大。

Countess 3 和 Countess 3 FL 细胞计数器可以消除许多主观变量并节省时间。这些仪器采用先进算法自动确定最佳焦距和光强度，并通过定量测量（如细胞大小、亮度和圆度）来筛选细胞，而非依赖操作员的判断，从而减少主观性误差并提高样本和用户间的重复性（图1）。

图1. 血球计数板与 Countess 3 FL 仪器的用户间变异性比较。三名实验者员分别使用 Countess 3 FL 细胞计数器对 PBMC、CHO-K1、HeLa、HEK293 和 Jurkat 细胞的单一样本进行计数，随后使用血球计数板和显微镜手动计数。血球计数板的用户间变异性显著高于 Countess 3 FL 仪器。

计数的细胞数量
在实际操作中，许多研究人员未计数足够数量的细胞，导致细胞计数结果不可靠且标准差较高。为了节省手动计数时间，许多用户仅计数传统血细胞计数仪网格中的一两个方格。增加计数方格（即更大的面积）通常会提高结果的一致性，但需要更多时间。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪在10秒的计数时间内可覆盖近四个传统血细胞计数仪方格的等效面积，从而通过减少细胞分布变异的影响提高计数一致性（图2）。

图2. 计数面积。Countess 3 仪器的计数面积与传统血细胞计数仪的对比。

重复计数

无论采用何种细胞计数方法，多次重复计数均可减少样本的变异性。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器可在血细胞计数仪完成一次计数（最多5分钟）的时间内完成多次重复计数，从而提高结果的准确性和可信度。由于时间限制，尤其是在需要计数多个细胞样本时，重复计数常被手动计数方法忽略。

成团细胞

对于含有成团细胞的样本，手动计数和某些自动细胞计数仪难以获得准确结果。成团细胞的常见挑战在于如何区分细胞边界以确定团块中的细胞数量。某些自动细胞计数仪仅能准确计数不超过五个细胞的团块。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器的先进计数算法可清晰识别复杂细胞团块中的边界，从而提供准确的细胞计数（图3）。

除了识别团块中的单细胞外，Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪还能检测细胞聚集并测量样本中的总聚集百分比。屏幕显示通过不同颜色区分团块和单细胞，明场模式则可直观确认团块中的细胞。

图3. 即使样本中存在成团细胞，仍能获得准确计数。Countess 3 细胞计数器的分割和计数算法成功解析了 U2OS 人骨肉瘤细胞样本中的团块，并显示样本中的聚集百分比。

荧光细胞计数
荧光细胞计数相比非荧光方法具有多项优势：背景对比度更高，便于识别和计数细胞；可使用不同荧光标记区分和计数多种细胞类型；减少将碎片误判为细胞的可能性，从而提高结果准确性。

Countess 3 FL 自动细胞计数仪配备两个可选的可互换荧光通道，通过插入不同光立方收集颜色（提供超过20种光立方）。仪器自动确定最佳照明条件，并支持两种计数模式：明场和荧光。明场模式利用明场图像识别细胞并快速报告荧光阳性细胞百分比；荧光模式则通过一个或两个荧光通道计数所有荧光对象，并报告总计数及各通道的荧光细胞分布（图4）。

图4. 使用 Countess 3 FL 自动细胞计数仪和两个光立方进行荧光细胞计数。细胞经 Invitrogen™ ReadyCount™ 绿/红细胞活性染色（货号 A49905）后，采用两种方法计数：（A）明场模式下的 U2OS 细胞，显示所有识别细胞；（B）荧光模式下的 PBMC，仅显示荧光阳性细胞。

节约成本
采用自动细胞计数仪的阻碍之一是专用一次性载玻片的持续成本。血细胞计数仪可无限次清洗和重复使用，而许多自动系统需依赖一次性载玻片。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪设计兼容可重复使用的玻璃载玻片（图5），同时也支持一次性载玻片。这一创新使实验室能够在无需承担高昂耗材成本的情况下采用先进的细胞计数方法。

图5. Countess 3 FL 自动细胞计数仪的可重复使用载玻片有助于降低耗材成本。

节省时间
手动计数（最多5分钟）与 Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪（几十秒）的时间差常被忽视。若每天计数五张载玻片（每张两个样本），改用自动计数器搭配可重复使用载玻片每月可节省约10小时；使用一次性载玻片则可节省约15小时（图6）。这些时间可用于实验室的其他工作，从而显著提升效率。

图6. 从手动计数切换到自动细胞计数仪后，每月预估节省的时间。

可获取的信息
血细胞计数仪仅能提供样本中的总细胞数、活细胞数和死细胞数。自动细胞计数仪还可获取更多数据，如平均细胞大小、基于荧光强度或细胞大小的分布直方图（图7）。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器可将数据以 CSV 格式保存至 USB 驱动器，原始图像和结果界面也可保存并传输至电脑。

图7. 结果显示平均细胞大小和细胞大小分布，有助于靶向特定细胞群。

Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪与血球计数板的细胞计数对比总结
自动细胞计数相比手动计数具有显著优势，包括更高的准确性、简化的工作流程和大幅节省的时间。尽管存在这些优势，一次性载玻片的成本曾是采用自动细胞计数技术的障碍。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪兼容可重复使用载玻片，降低了自动细胞计数的成本，使更多实验室能够负担这一先进技术，从而获得更快、更准确的计数结果。

对于需要 较高通量、高准确性 的现代实验室，Countess 3 自动细胞计数仪 是比传统血球计数板更优的选择。它不仅解决了手动计数的固有缺陷（如主观性和低效性），还通过 自动化、荧光分析和可重复使用耗材 进一步降低了实验成本。

Countess 自动细胞计数仪特点

引入人工智能，助力 Countess 3 全自动细胞计数仪像细胞生物学家那样“思考”，从而以简单、快速并且以自动方式生成准确、可重复的计数结果。其应用范围不仅限于计数，还扩展到细胞活性、细胞凋亡、转染效率等方面。

准确且精确

当您使用自动化设备进行细胞计数时，它的准确性和精确度和您一样，甚至更佳。准确性意味着它会正确地进行细胞计数，精确度意味着无论操作者是谁，它每次都会产生相同的结果。

引入人工智能。Countess 3（明场）和 Countess 3 FL（明场和荧光）全自动细胞计数仪值得信任，它们使用深度学习神经网络算法开发，每次都能进行准确的计数。该算法是由专业科学家根据包含数十种不同细胞类型和样品的数百个培养板进行细胞识别优化而成。

由此打造的细胞计数仪能够像细胞生物学家一样“思考”，即便是外周血单核细胞 (PBMC)、成团细胞以及含细胞碎片等具有挑战性的细胞样品也可轻松胜任。在高分辨率的 Countess 屏幕上，您可以看到正在计数的细胞以及未计数的细胞碎片。

与手动血球计数板的计数相比，使用 Countess 3 进行自动化细胞计数可以减少多种原因造成的数据错误和差异，包括操作者主观性、视觉疲劳、计数区域差异和挑战性样本。Countess 3 细胞计数仪兼具手动细胞计数的准确性和流式细胞仪计数的精确度，而又无需流式细胞术所需的支出或培训。

机器学习算法可实现准确的细胞计数，可与流式细胞仪计数媲美。

使用 Attune NxT 流式细胞仪（紫色直方图）、Countess 3 FL 全自动细胞计数仪（红色直方图）以及血球计数板和显微镜（手动计数，灰色直方图）对 CHO-K1、HeLa、HEK293、Jurkat 和人 PBMC 进行了计数。 Countess 3 FL 仪器和血球计数板直方图代表了 6 个独立计数的平均值且高度一致。手动计数的误差（计数的标准差）要比 Countess 3 计数或流式细胞仪计数更宽。

扩展计数区域。为了节省手动计数的时间，许多实验人员只对血球计数板网格上的一个或两个方块进行计数。计算更多方块（更大区域）通常会获得更准确的结果，但需要额外增加时间。Countess 3 全自动细胞计数仪查询的区域接近包含四个方块，通过减少细胞分布变化的影响提高了准确性。并且 Countess 可以在不到 30 秒的时间内完成自动聚焦、自动亮度调整、图像采集和计数。

手动细胞计数与自动化细胞计数的计数区域对比

Countess 3 的计数区域约为标准血球计数板的 3.8 倍。

处理成团细胞和碎片。由于难以辨别细胞之间的边界，因此成团细胞难以进行手动计数，甚至对自动化计数仪也具有挑战性。样品含有碎片则进一步增加了计数的复杂性。Countess 3 全自动细胞计数仪可以在进行细胞计数时自动排除碎片，其先进的算法可以清楚地识别细胞团块内的细胞边界，从而实现高度准确的细胞计数。

先进的算法可实现对成团细胞和样品碎片的准确计数。

在明场模式下使用 Countess 3 FL 全自动细胞计数仪对微小且容易成团的 RAW（小鼠小噬细胞）进行了计数。计数算法能分辨出团块中的细胞，正确圈出细胞并对细胞进行计数。活细胞具有绿色轮廓，死细胞则具有红色轮廓。碎片（未勾勒轮廓）会在计数时自动忽略。

快速

Countess 3 全自动细胞计数仪能在不到30 秒的时间内产生结果。通过快速采集、自动亮度调整、自动聚焦和自动保存，用户需要做的就是加入样品和插入细胞计数板。细胞培养实验室的时间十分珍贵，使用 Countess 3 自动细胞计数仪，即可快速完成细胞计数等多种分析。              

除了计数速度飞快外，Countess 3 系统还精简了细胞计数的流程，淘汰了许多与手动细胞计数相关的繁琐步骤，其中包括亮度和聚焦调整、计算细胞浓度以及制作报告。节省了更多的时间。如果您的实验室每天计数五张玻片，可以每月节省 10–15 小时（具体取决于所选玻片）；如果您每天计数 25 张玻片，则可以节省 50–75 小时！这些额外获得的时间可以用来完成实验室的细胞培养处理和其他活动，在从手动细胞计数切换到全自动细胞计数方面具有显著优势。

简单

使用 Countess 3 或 Countess 3 FL 全自动细胞计数仪在明场模式下进行细胞计数的过程简单而又轻松。只需准备计数板，启用快速捕获和自动保存，然后插入计数板。其余工作交给仪器自动完成：亮度调整、聚焦和计数。

自动化细胞计数不仅比手动计数操作更简单，而且需要的操作培训也更少。

灵敏的触摸屏和直观的界面。直观易用的Countess 3 全自动细胞计数仪软件。灵敏的 LCD 触摸屏不需要外部计算机。该屏幕的 1280 x 800 分辨率提供高质量的细胞图像，可通过辅助工具进行活/死细胞计数，使用 Countess 3 FL 全自动细胞计数仪，可实现荧光可视化。显示屏与整个仪器齐平，便于清洁。

触摸屏界面可以轻松显示计数的细胞群，例如，创建“门”，根据细胞大小、亮度、圆度和/或荧光强度从计数中排除不需要的细胞。  通过选择结果屏幕右上角的图形图标，在直方图或散点图中查看您的细胞信息。当使用滑块控件调整门控参数时，您可以实时查看直方图或散点图的变化。为方便起见，柱状图底部显示平均细胞大小（用于明场计数）或荧光强度（用于荧光计数）。

触摸屏界面可以让您从结果屏幕快速移动到直方图和散点图屏幕。 直方图和散点图可根据大小、亮度和圆度显示细胞群和设门。

直观的设门界面

在此散点图中，细胞群被视为活（绿色）和死（红色）群。轴的大小和圆度可以改变。

在此直方图中，根据细胞数量和相对荧光单位 (RFU) 绘制细胞群。使用右侧的设门场和明场 (BF)，您可以使用设门菜单左侧的滑块根据大小、亮度和圆度进行设门。如果选择德州红 (TX Red) 或 GFP，则可以执行 RFU 强度的设门。

自动

使用 Countess 3 全自动细胞计数仪时，不仅计数自动化完成，系统还会自动调整亮度和聚焦以获得最佳对比度和分辨率，并会自动保存细胞计数和数据（如果您选择该选项）。软件还包括方便的内置预稀释和细胞传代计算器，这些为细胞培养工作提供很大便利。

预稀释计算器

如果您的细胞样品是浓缩样品，您在计数前进行了稀释，请在此处输入样品和缓冲液体积，Countess 3 细胞计数仪会自动重新计算样品浓度。该浓度还将考虑添加台盼蓝进行明场活性测定。

细胞传代计算器

如果您的下游实验确定特定浓度的样本，请在此处输入所需浓度和体积、Countess 3 细胞计数仪将自动计算所需的细胞样品和缓冲液或细胞培养基量。计算时将自动包括您的细胞计数结果。

保存结果和报告。您可以将细胞计数结果、细胞数据和图像保存到 USB 驱动器，或使用 Wi-Fi 保存到 Thermo Fisher™ Connect 云端平台。结果保存为兼容电子表格的 CSV 文件，细胞数据保存为流式细胞仪标准 FCS 文件，而图像可以保存为 TIFF、PNG 或 JPG 格式。在实验室内外随时访问这些文件——您可以在需要时随时随地获得数据。

您还可以保存包含结果、图像和设置可打印的 PDF 报告。

不局限于计数的应用

Countess 3 全自动细胞计数仪的功能远非单纯的细胞计数。利用台盼蓝染色，您可以评估样本中活细胞的百分比。或者，使用 Countess 3 FL 系统检测荧光染料，进行更复杂的活性分析、检测凋亡和细胞死亡的不同阶段、测量转染效率，以及其他应用。

单细胞数据。Countess 3 全自动细胞计数仪可分析和存储您样品中每个细胞的数据。您可以放大任何细胞并显示其大小、亮度、圆度和荧光值。您还可以流式细胞仪标准 (FCS) 格式生成散点图，并在多种流式细胞仪软件分析程序中分析、转换数据和重新设置数据格式。

多样化的细胞系和细胞样品。Countess 3 全自动细胞计数仪的计数算法已在一组不同的细胞样本上进行了训练，您可以相信Countess 3 全自动细胞计数仪能够实现高准确度的细胞计数。下表列示了在 Countess 3 和 Countess 3 FL 全自动细胞计数仪上进行了测试和验证的细胞类型和细胞系。

兼容可重复使用计数板

两种 Countess 3 自动细胞计数仪均可使用 Invitrogen Countess 可重复使用计数板，可重复计数板可避免一次性计数板的浪费。即使您的实验室每天只使用五张计数板，通过使用可重复使用的计数板，可显著减少每年造成的浪费。这使得实验室能够负担起细胞计数自动化的成本，不会产生一次性计数板的持续性花费。

Invitrogen Countess 细胞计数板一次性计数板，无需像可重复计数板那样进行清洁，然后在细胞样品的处理间隔等待其干燥。需要处理大量细胞样品，为了减少污染风险或处理有害样本时，一次性计数板使用方便，可快速处理细胞样品。

符合 21 CFR 第 11 部分要求的支持软件

Countess SAE 软件解决方案是一个选配软件模块，支持电子记录保存，符合美国食品和药品监督管理局（FDA）的“电子记录和签名规则”、“联邦法规”第 21 篇第 11 部分（21 CFR 第 11 部分）的要求。该法规对使用电子文件代替纸质文件做出了规定。

21 CFR 第 11 部分合规性包括规程要求和技术要求。

· 规程要求是最终用户机构所制定的标准操作程序。

· 技术要求是所使用的合规性管理软件的功能特征。

仅满足技术要求并不能保证 21 CFR 第 11 部分合规性。合规性由机构的工作流程和所用系统两者决定。

软件的功能包括限制未经授权的用户、密码策略和失效日期、定义的用户权限和角色、通过审计日志、审计报告以及机载电子签名工作流程跟踪所有数据更改。购买 Countess SAE 软件许可证后，所有 Countess 3 和 Countess 3 FL 全自动细胞计数仪都可以在 SAE 模式下运行。要实现 21 CFR 第 11 部分合规性，机构还需要以合规方式制定和记录标准操作程序。

#细胞计数# #细胞计数仪# #自动细胞计数# #全自动细胞计数仪#

赛默飞世尔科技（中国）有限公司