手机版
Ky开元集团手机版
Ky开元集团小程序
官方微信
公众号：chem17
扫码关注视频号
蛋白测序是解析蛋白质氨基酸排列顺序的核心技术，主要分为传统化学法、质谱分析法和新兴单分子技术三大类。以下是主流方法的原理、流程及适用场景详解：
? 一、传统化学法：Edman降解
原理：
从蛋白质N端逐级切割氨基酸，通过苯异硫氰酸酯（PITC）标记→环化裂解→HPLC鉴定释放的氨基酸衍生物（PTH-AA）。
流程：
变性处理：用6M盐酸胍解开蛋白高级结构
N端封闭：乙酰化防止非目标反应
循环反应：
碱性条件与PITC结合
无水三裂解N端氨基酸
萃取PTH-AA进行HPLC分析
特点：
? 优势：可测N端15-60个氨基酸（纯度＞95%时）
? 局限：
不能处理N端封闭蛋白（如乙酰化蛋白）
通量极低（1样本/小时）
需≥10 pmol纯化蛋白
应用场景：抗体CDR区短肽验证、重组蛋白N端质检
?? 二、质谱分析法（主流技术）
1. 自上而下（Top-Down）
原理：
完整蛋白离子化（电喷雾ESI）→高分辨质谱（如Orbitrap/FT-ICR）直接测序。
流程：
特点：
保留翻译后修饰（PTM）信息
需超高性能质谱（分辨率＞100,000）
适用分子量＜50 kDa蛋白
2. 自下而上（Bottom-Up）
原理：
蛋白酶解→肽段分离→串联质谱（MS/MS）测序→算法拼接。
关键步骤：
酶解：Trypsin（切割K/R位点）、Lys-C等
色谱分离：nanoLC梯度洗脱（C18柱）
碎裂方式：
类型 适用场景 特点
CID（碰撞诱导解离） 小肽段（＜2 kDa） 易丢失修饰信息
ETD（电子转移解离） 磷酸化/糖基化修饰 保留不稳定修饰
HCD（高能碰撞） 通用型（灵敏度高） 碎片覆盖全面
数据库搜索工具：
Mascot、MaxQuant（标记定量）
de novo算法：PEAKS（无需数据库）
特点：
通量高（可并行数百样本）
需μg级蛋白起始量
可定位修饰位点（如磷酸化Ser/Thr）
? 三、单分子测序技术
1. 纳米孔蛋白测序（Oxford Nanopore）
原理：
蛋白变性为线性多肽→通过纳米孔时引起电流变化→AI解码氨基酸序列。
突破性：
直接读取翻译后修饰（如磷酸化酪氨酸电流特征）
2023年实现单分子精度（误差＜5%）
2. 荧光标记测序（Fluorosequencing）
流程：
将20种氨基酸分为5组，每组用特异荧光染料标记
蛋白固定于载玻片，逐轮切除N端氨基酸
每轮显微成像识别荧光颜色→对应氨基酸组
特点：
适合低丰度蛋白（zeptomole级）
商业平台：Erisyon™（2024年推出）
?? 四、方法选择决策树
? 五、前沿进展与挑战
AI辅助：
AlphaFold2预测结构辅助序列验证
DeepMSn实现95%准确度的de novo测序
挑战：
膜蛋白等难溶样本的处理
同分异构体（如Leu/Ile）区分
单氨基酸变异（SAV）检测限＞0.1%
实用建议：
常规研究Bottom-Up质谱（成本≈¥800/样本）
抗体药物开发需结合Edman降解+质谱
探索性研究关注纳米孔实时测序（通量＞100样本/天）
免责声明
- 凡本网注明“来源：Ky开元集团”的所有作品，均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-Ky开元集团合法拥有版权或有权使用的作品，未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的，应在授权范围内使用，并注明“来源：Ky开元集团”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源（非Ky开元集团）的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品第一来源，并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。
采购中心
