生物药电荷异构体分析难题如何破？MauriceFlex +MS来解锁！

在生物药研发中，抗体的电荷异构体直接影响药物疗效与安全性。离子交换色谱（IEX）操作繁琐且分辨率有限，传统的毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）常因高浓度缓冲液与ESI不兼容，导致数据偏差。《Electrophoresis》期刊发布的一项研究利用MauriceFlex进行电荷异构体的快速分离，并进行质谱分析，为这一难题提供了高效的解决方案。

研究以单克隆抗体Matuzumab为测试对象，通过MauriceFlex仪器实现了电荷异构体的快速分离和离线质谱分析。结果显示，MauriceFlex不仅能够高效地分离电荷异构体，还能与质谱无缝对接，提供高分辨率的分析结果。这种方法不仅克服了传统方法的局限性，还显著提高了分析的准确性和可靠性，为单克隆抗体的深层表征提供了全新的视角。

01. 研究方法

(1) 毛细管等电聚焦电泳（icIEF）：使用MauriceFlex仪器进行icIEF分析，分为分析型和制备型（馏分收集）两种模式。分析型icIEF建立基础分离条件，制备型icIEF通过增加样品浓度和添加精氨酸优化馏分收集，通过化学迁移技术将电荷异构体馏分收集至96孔板。

(2) 荧光检测：通过荧光测量确定96孔板中含有蛋白质的孔位。

(3) 质谱分析（MS）：使用高分辨率质谱仪对收集的电荷异构体进行分析，解析其结构特征。

(1) 方法适用性验证

使用MauriceFlex仪器仅用1天完成了从分析型cIEF转化为制备型馏分收集的方法开发，并在2.5小时内完成了高纯度电荷异构体馏分收集。结果发现分析型与制备型cIEF的峰数量相同，方法转化后分离效果良好，表明从分析到制备的方法转换可靠，为后续质谱分析提供了可靠的样本。

图1 Matuzumab的分析型icIEF(上)与制备型icIEF馏分收集电泳图(下)对比

(2) 方法稳定性评估

为了评估馏分收集方法的稳定性，将Matuzumab样品在制备型icIEF模式下独立收集三次（Run1- Run 3），通过分析型icIEF对每次收集的馏分进行验证（图2），结果显示各电荷异构体在不同分离批次中的峰形和位置高度一致，表明MauriceFlex制备型icIEF（馏分收集）具有良好的重现性和准确性。尽管三次实验馏分在96孔板中分布位置存在微小偏移（1-2孔），但通过分析型icIEF验证可轻松匹配对应馏分，验证了馏分收集过程的稳定性。

图2 Matuzumab样品三次馏分收集后的分析型icIEF结果

(3) 质谱分析

使用高分辨率质谱仪检测未分离的Matuzumab抗体和经过MauriceFlex分离的馏分，发现未分离的样品质谱信号重叠严重，而经MauriceFlex分离的馏分在质谱图上显示出更清晰和特异的峰，表明MauriceFlex有效地富集了特定的电荷异构体。通过质谱成功鉴定了包括C末端赖氨酸异构体（K2、K1、K0）糖基化异构体（FA2和A2G1），这些发现对于理解单克隆抗体的结构和功能具有重要意义。研究还发现了一些未报道过的酸性异构体，表明MauriceFlex馏分收集和质谱的分析方法能有效揭示复杂电荷异构体的结构信息。

图3 非分馏样品（上）与icIEF馏分（下）的质谱对比

作者以Matuzumab为测试对象，成功开发了分析型icIEF方法，并快速转化为制备型icIEF方法，2.5小时内完成高纯度电荷异构体馏分收集，质谱分析则清晰揭示了包括C末端赖氨酸异构体、糖基化异构体在内的多种电荷异构体，甚至发现了一些未报道过的酸性物质。MauriceFlex+MS联用方法不仅克服了传统方法的局限性，还显著提高了分析的分辨率和准确性，为单克隆抗体的深层表征提供了全新的视角。

MauriceFlex全自动毛细管电泳分析与组分收集系统

* 参考文献：Wittmann, Antonia et al. Evaluation of a cIEF Fractionation Workflow for Offline MS Analysis of Charge Variants of the Monoclonal Antibody Matuzumab. Electrophoresis. 2025;46(3-4):240-249.

* 本文转载自「ProteinSimple」微信公众号