蛋白纯化仪实验步骤全流程技术要点概述-赛默飞

蛋白纯化是蛋白研究的重要部分。蛋白质功能性、结构和相互作用的研究在很大程度上视已分离感兴趣蛋白的纯度和质量而定。在这里，我们向您介绍可帮您满足需求的五步法实验流程。了解蛋白表达、蛋白提取和保存、蛋白纯化、蛋白除杂和蛋白定量及检测的方法和技术。

蛋白纯化实验步骤

步骤一：蛋白表达-选择适合您生产需求的表达系统

要生产用于早期发现研究（一直到大规模生产生物治疗药物）、疫苗研发和结构研究的重组蛋白，研究人员有多种方法可以选择。必须针对感兴趣的靶蛋白和应用使用正确的蛋白表达系统。我们提供众多出色的哺乳动物、昆虫、细菌和酵母菌蛋白表达系统以满足您的研究需求。

我们的 Gibco Expi 瞬时表达系统采用哺乳动物（CHO-S、293F 细胞）和昆虫（Sf9 细胞）表达形式，是经过优化的系统，可快速、高产量地生产蛋白。

ExpiCHO 和其他瞬时 CHO 表达系统中的重组蛋白滴度。所示为人 IgG、兔 IgG 和促红细胞生成素在 ExpiCHO 和其他瞬时 CHO 表达系统中的表达水平。ExpiCHO 滴度是其他瞬时 CHO 表达系统的 25–160 倍。

产品推荐

ExpiCHO 表达系统：Gibco ExpiCHO 表达系统是一款经优化的完整系统，由 ExpiCHO-S(TM) 细胞组成，这些细胞在 ExpiCHO(TM) 表达培养基中可适应高密度、无血清的悬浮培养，再加上经特殊设计的转染试剂和增强剂，可在瞬时系统中实现较高产量（多达 3g/L）。这意味着您可从 CHO 细胞开始研究工作，并在发现过程中始终使用 CHO 细胞。

Expi293 表达系统 ：Gibco Expi293 表达系统是一款经优化的完整系统，由 Expi293(TM) 细胞组成，这些细胞在 Expi293(TM) 表达培养基中可适应高密度、无血清的悬浮培养，再加上经特殊设计的转染试剂和增强剂，可在五到七天的短短时间内实现重组293来源的重组蛋白表达，蛋白产量是前几代瞬时表达系统的 2-10 倍

ExpiSf 表达系统：ExpiSf 表达系统是化学成分确定的杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统，采用快速、简化的工作流程，每次实验都可达到高产量（蛋白超过3倍多）和出色的一致性。

小贴士

开始使用 Expi 瞬时表达系统时，请确保检查以下事项：

? 检查您的 DNA：260:280 比、260:230 比和转染前的 DNA 浓度

? 检查您的试剂储存条件：4-8°C 且避光

? 检查您的培养箱：确保显示温度、CO2% 和湿度是准确的，且分别为 37°C、8% 和 80%

? 检查您的细胞：确保倍增时间、活力和细胞直径均理想，可立即转染

? 检查您的体积：确保您的培养体积是對的：烧瓶尺寸比为 1:3.6（1:3 – 1:4 就可以）

? 检查您的速度：增加体积会降低速度；减少体积会增加速度

蛋白表达产品

步骤二：蛋白提取和稳定-从样本中提取并稳定您的靶蛋白

蛋白提取技术因原始材料的来源、感兴趣蛋白在细胞内的位置以及下游应用而异。其他重要的考虑因素包括保持蛋白活性和功能以及降低背景影响。

蛋白提取

组织和细胞裂解

过去，人们使用机械破坏裂解细胞和组织；我们开发的温和、去垢剂型解决方案旨在有效地裂解细胞并实现亚细胞结构的分离但无需物理破坏，实现活性蛋白的高产量。

蛋白提取产品的特点：

? 经过优化—配方较大程度地提高蛋白产量并保持蛋白活性

? 高效—仅亚细胞组分之间出现较少交叉污染

? 兼容—提取物可直接用于大多数下游应用

? 温和—无需对大多数样本类型进行机械细胞破坏

在多种哺乳动物细胞类型和细胞腔室中实现高蛋白产量

使用 M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂从主要细胞腔室中提取蛋白的效率。使用 M-PER 试剂从规定细胞系和原代培养物制备裂解物并评估了从多种细胞腔室中提取的效率。对于各靶蛋白，加入 10 μg 裂解物以便通过 SDS PAGE 电泳、转印到硝酸纤维素膜上并使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物进行蛋白质免疫印迹检测。

使用 M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂从各种细胞类型中提取蛋白的产量。在汇合度为 85% 时收集细胞，清洗两次并在冰浴的 PBS 中收集，然后计数。对于每种细胞类型，将 1 x 106细胞通过 2,000 x g 离心 5 分钟进行沉淀，并在 1 mL M-PER 试剂中裂解 5 分钟。通过以 14,000 x g 离心 10 分钟澄清细胞裂解物，收集上清液并使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度（µg/百万细胞）

膜蛋白的高效选择性富集

使用 Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒提高蛋白产量。使用 Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒及其他三种商用提取试剂盒从小鼠肝组织和 HeLa 细胞中分离膜蛋白。利用 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量试剂盒对膜、细胞质和总蛋白的产量 (μg) 进行测定。

从各种组织中高效提取蛋白

使用 T-PER 组织蛋白提取试剂提取组织细胞裂解蛋白的产量。对重复的组织样品进行称重，以1:10至1:20 w/v T-PER 试剂重新悬浮，并在冷冻的 Dounce 或台式组织均质仪中破碎。在 10,000 x g 下离心所得裂解物5分钟并收集上清液。通过 Pierce BCA 蛋白定量测定每种裂解物的蛋白浓度，从而确定每毫克起始组织的蛋白产量。

从细菌细胞中高效提取蛋白

两种细菌细胞裂解试剂的蛋白产量比较。将大肠杆菌 ER2566/pLATE51-Klenow、ER2566/pGST-CC-StpB 和 ER2566/pGS-Syk 细胞沉淀物 (0.5 g) 重悬于 Thermo Scientific B-PER 全套细菌蛋白提取试剂或 EMD Chemicals BugBuster 预混液的 2.5 mL 等分试样中，室温下轻轻涡旋15分钟。在 4°C 下以 16,000 x g 离心20分钟，去除不溶性细胞碎片。使用 Pierce BCA 蛋白测定试剂盒 测定可溶性组分的蛋白产量（浓度）。

去垢剂溶液

去垢剂常用于细胞裂解试剂配方及其他蛋白研究方法。Thermo Scientific Surfact-Amps 去垢剂溶液采用高纯度、预先精确稀释 (10%) 的配方，非常适合用于对未纯化去垢剂中的杂质敏感的应用或测定。

蛋白去垢剂产品特点：

· 精准——精确溶解于超纯水中的10％去垢剂溶液

· 易用——溶液易于分配和进一步稀释

· 高纯度——过氧化物和碳基含量低于 1.0 μq/mL

· 稳定——在惰性氮气条件下装入玻璃安瓿或 HDPE 瓶中

去垢剂分子的一般结构。

蛋白稳定

细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致酶活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止这些不利影响，需要向裂解试剂中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。现已发现多种可以破坏或抑制蛋白酶和磷酸酶活性的化合物。

蛋白酶和磷酸酶抑制剂产品特点：

· 使用便捷——公开的即用型广谱配方，提供浓缩液液、片剂或胶囊的形式，以及多种包装规格，有效期至少为1年

· 全面保护——蛋白酶和磷酸酶抑制剂二合一配方，以液体和片剂的形式提供（含 EDTA 或不含 EDTA）

· 兼容——可搭配 Thermo Scientific Pierce 细胞裂解试剂及其他基于去垢剂的商用或自制裂解液使用

对蛋白酶和磷酸酶的广泛有效抑制

三种市售蛋白酶抑制剂片剂的性能比较。在含或不含 EDTA 且分别添加了 Thermo Scientific Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂、Roche™ Complete™ 蛋白酶抑制剂片剂、Sigma-Aldrich™ SIGMAFAST™ 蛋白酶抑制剂混合物片剂的情况下，胰腺提取物（100 μL；0.5 μg/μL）与猝灭的荧光胰蛋白酶、半胱氨酸、金属蛋白酶和组织蛋白酶裂解底物一起孵育。37°C 下孵育1小时，并在相应的发射波长下测定荧光信号。图片显示了各种蛋白酶抑制剂配方的抑制效率。

Thermo Scientific 磷酸酶抑制剂迷你片剂大幅度保持了细胞提取物中的蛋白磷酸化。(A) 对 HCT116 细胞进行血清饥饿处理，用 EGF 刺激15分钟，或留作对照细胞。在 Thermo Scientific Pierce IP 裂解缓冲液中，以 Thermo Scientific 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂、不含 EDTA 或者不使用抑制剂的情况下，制备细胞裂解物。将包含 500 μg 蛋白的裂解物与 5 μg 磷酸酪氨酸抗体在 4?C 下孵育过夜。然后将抗体复合物与 Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠在室温下孵育1小时。漂洗磁珠并在低 pH 值下洗脱。洗脱物通过蛋白免疫印迹进行检测，使用 EGFR 抗体检测膜后进行化学发光检测。（B）在分别添加 Pierce 磷酸酶抑制剂迷你片剂、Roche™ PhosStop™ 磷酸酶抑制剂片剂以及 Sigma-Aldrich™ 磷酸酶抑制剂混合液2和3的配方情况下，通过将提取物与可测量磷酸酶活性的荧光底物（MFP 或 FDP）一起孵育，从而测定肾脏提取物（25μL；0.5 μg/μL）中对蛋白磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的抑制程度。37°C 下孵育1小时，并在相应的发射波长下测定荧光信号。图片显示了各种磷酸酶抑制剂配方的抑制效率。

小贴士

· 细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

· 大多数研究人员会使用几种不同抑制剂的混合物，以确保蛋白提取物在感兴趣靶标分析之前不被降解。蛋白酶抑制剂基本在所有蛋白提取中都需要使用，而磷酸酶抑制剂仅在研究磷酸化状态时才需要使用。

· 通过 SDS-PAGE 分析溶解蛋白和不溶性组分样品，可测定所用蛋白提取方法的效率。

蛋白提取和蛋白酶抑制剂产品选择指南

组织和细胞裂解

用于溶解蛋白的去垢剂

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

步骤三：蛋白纯化-纯化和富集您的蛋白样本

可以使用各种方法在细胞裂解原液或其他样本中富集或纯化来自其他蛋白和组分的感兴趣蛋白。离子交换和亲和层析是部分或一步纯化中常用的两种策略。

亲和纯化

此纯化方法也被称为亲和层析，通过将蛋白与固定化配体的特异性结合的性质实现。由于感兴趣蛋白紧密结合，可以通过洗涤步骤去除污染物，可以从支持物中以高度纯化的形式剥离（洗脱）结合的蛋白。亲和纯化是令人满意的方法，因为它通常具有较高的蛋白产量并且所需步骤比其他纯化方法少。它是纯化重组或生物素化蛋白和抗体的优选方法。

离子交换 (IEX) 纯化

该纯化方法也被称为离子交换层析，可以在特定 pH 下根据蛋白电荷进行分离。由于多个蛋白可能有类似的电荷，在多步纯化过程的早期使用时，IEX 层析通常仅能部分纯化感兴趣蛋白。但是，IEX 树脂也可以在最后精细纯化步骤中用于去除其他纯化步骤后持续存在的特定污染物。通常，蛋白在低离子强度下与 IEX 柱结合并通过在梯度下增加盐浓度或更改 pH 值来差异地洗脱。阳离子交换树脂与带正电荷的蛋白相结合；阴离子交换树脂与带负电荷的蛋白相结合。离子交换树脂被归类为“弱”或"强"，这是指官能团的电离状态随着 pH 值变化的程度。

蛋白纯化的原理

1. 结合：使用特定配体捕获感兴趣蛋白。

2. 洗涤：在洗涤阶段去除不需要的蛋白和其他杂质，如核酸。

3. 洗脱：此步骤反转结合反应。您可以通过改变缓冲条件（如 pH 值、盐浓度和去垢剂）或者加入竞争性结合物来洗脱和富集靶蛋白。

4. 精细纯化：通过额外的层析步骤（通常为离子交换或体积排阻）充分利用靶蛋白的已知特性来去除剩余的微量杂质和其他污染物。

蛋白纯化工作流程

使用 Pierce anti-DYKDDDDK 树脂和其他产品的 DYKDDDDK 标签 SUMO 蛋白产量和背景的比较。C 端和 N 端 DYKDDDDK 标签的 SUMO 蛋白在大肠杆菌中表达并使用 Pierce Anti-DYKDDDDK 磁性琼脂糖、Sigma-Aldrich® Anti-FLAG™ M2 磁珠和 MBL Anti-DDDDK 标签 mAb 磁性琼脂糖纯化。用 Pierce 3x DYKDDDDK 肽竞争性洗脱标签蛋白，通过使用 Invitrogen iBright 成像系统(B) 的 SDS-PAGE(A) 和密度测定法分析结果。起始裂解物和洗脱组分间的比较显示了 DYKDDDDK 标签蛋白的有效免疫沉淀和洗脱，与其他供应商产品相比，Pierce 磁性琼脂糖的背景很少。

蛋白纯化产品的特点：

· 产品选择广—可纯化和富集蛋白和抗体的强离子交换和亲和支持物；亲和配体可实现重组和生物素化蛋白的1步纯化，同时，活化的支持物可为定制蛋白固定化提供平台

· 高性能—树脂旨在较大程度地增加蛋白产量和减少背景

· 多种规格—磁珠、松散树脂、FPLC 纯化柱和96孔过滤板可实现从筛选和小规模阶段到工艺规模纯化的蛋白纯化

· 经济实惠—价格接近于其他主要供应商的价格或更优惠

离子交换、亲和和活化支持物的概述

根据纯化规模和应用选择您的树脂

小贴士

蛋白纯化过程因要执行的下游分析而异。可以重复或省略某些步骤以获得所需的结果。

步骤四：蛋白除杂-蛋白样本除杂

蛋白提取配方中使用的许多去垢剂及盐可能对蛋白功能或稳定性产生不良影响，或者可能干扰下游分析。因此，在细胞裂解或后续样本处理（如蛋白纯化）后，可能有必要去除或减少这些污染物。

小贴士

· 如果蛋白浓度太低而无法进一步处理或分析，可以使用离心浓缩管快速浓缩样品。

· 若要在浓缩技术中进行缓冲液置换，可以使用置换缓冲液稀释截留液并离心。此过程可以重复进行，直至达到所需置换或脱盐水平。

蛋白样本除杂产品

蛋白透析

透析是一种经典的除杂技术，它凭借选择地扩散通过半透膜来去除小分子和不需要的化合物。将样品和缓冲液置于膜的相对侧。大于膜孔的蛋白保留在膜的样品侧，较小的分子（污染物）通过膜自由扩散，直至达到平衡浓度。这种技术可以使样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。

蛋白透析产品的特点：

· 出色的样本回收率—与过滤和树脂系统相比，低结合塑料和膜有助于尽可能减少样本损失

· 便捷—易于抓握的设计有助于简化使用进样针和/或移液器添加和去除样本

· 安全—密封膜有助于防止使用透析管和自制设备可能发生的泄漏

· 经验证—每台设备都在生产过程中经过泄漏检测

产品推荐

*MWCO：截留分子量。

按截留分子量 (MWCO) 排列的蛋白回收率

使用 2K、3.5K、7K、10K 和 20K MWCO Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 透析盒膜的样本保留率。在 4°C 下，于盐水或 0.2 M 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 (pH 9.4) 中隔夜透析（17小时）各蛋白或维生素 B12 (1 mg/mL)。使用 Pierce BCA 蛋白测定试剂盒或者在 360 nm 处的吸收度（对于维生素 B12）评估保留物的量。

使用各种透析产品去除 NaCl 的速度。通过在指定时间测量保留物的电导率来确定样本中 NaCl 的去除情况。(A)Slide-A-Lyzer 迷你透析装置（10K MWCO，2 mL）与传统透析的比較。室温下，在轨道摇床 (300 rpm) 上用 50 mL 一次性锥形管中的 45 mL 水透析牛血清白蛋白 (BSA) 样本（2 mL，0.25 mg/mL，溶于 1 M NaCl 中）。2小时后，换一次水。结果是两个样本的平均值。对于传统透析，用烧杯中的 2 L 水通过搅拌透析样本。在4小时内，去除了 95% 的 NaCl。(B) 室温下，在 Pierce 96孔微量透析板中用 1.8 mL 水通过轻轻摇动透析 0.1 mL 样本（含 1 M NaCl 的 0.4 mg/mL 细胞色素 C）。在4小时内，于第1、2、3小时更换缓冲液。2小时后，去除了 >83% 的 NaCl；4小时后，去除了 >99% 的 NaCl。(C) 室温下，使用 2K、3.5K、10K 和 20K MWCO Slide-A-Lyzer 透析瓶透析含 1 M NaCl 的 200 mL 样本中的蛋白。2小时和5小时后，更换透析缓冲液 (4 L)（三角形；此外，在 2K 状态下是41小时）。在8至18小时内，去除了超过 95% 的 NaCl（2K 条件下为41小时）。

蛋白样本脱盐

体积排阻色谱法也称凝胶过滤法，可用于去除样本中的盐分。使用这种技术时，需要选择一种孔尺寸足以使小分子盐进入但感兴趣蛋白不能进入的树脂。这会使得污染物减缓其迁移率。在重力流或离心过程中，将较大、较快的蛋白与较慢、较小的分子分离。

蛋白脱盐产品的特点：

· 高性能—专有树脂可实现出色的蛋白回收和高效的污染物去除

· 灵活—可采用离心柱、过滤离心板和纯化柱规格以满足各种需求

· 快速—无需组分筛选或等待蛋白通过重力流出现

· 经济—产品价格实惠、性能出色

产品推荐

蛋白回收率和样本稀释度的比较

与其他产品相比，Zeba 离心脱盐柱可在较大样本浓度和体积範圍下達到對样本的较低稀释的同时,亦实现了高蛋白回收率。Zeba 离心脱盐柱（10 mL，7K MWCO）和 GE PD-10 柱用于对 0.04、0.2 和 1 mg/mL 浓度的 1.5、2.5 和 3.5 mL BSA 样本进行脱盐。根据制造商推荐的方案进行脱盐；针对 GE PD-10 使用离心和重力方案。利用 SDS-PAGE 分析蛋白回收率。对于各电泳凝胶，在泳道1中加入等于 1 μg BSA 的起始样本的等份试液作为上样对照品；在凝胶中加入体积相同的其他所有脱盐样本作为上样对照品。不同泳道之间的强度差异是脱盐引起的蛋白回收率和样本稀释度组合。回收和浓缩的最大差异均在突出显示的区域中注明。

蛋白浓缩管

蛋白浓缩与透析法类似，其使用半透膜将蛋白与小分子量化合物分离。与透析法的被动扩散原理不同，浓缩是使用离心使溶液穿过膜而实现的。在离心过程中，缓冲液和小分子量溶质均被动穿过膜，并在另一侧收集（滤液）。大分子（蛋白）保留在膜的样品侧，其随着试剂被动穿过膜到达另一侧而浓缩为小体积液体（截留液）。

蛋白浓缩管产品的特点

· 快速处理—设计可较大限度地减少膜积垢，且使用 10K MWCO 浓缩管时，在 5-30 分钟内可将样本浓缩 10-30 倍（使用其他 MWCO 浓缩管时，浓缩时间可能不同），即使是带粒溶液亦是如此。

· 高回收率—在去除污染物或置换缓冲液的同时，保留 >90% 的蛋白样本

· 方便—醒目标记、宽样本槽和可拆卸过滤槽便于轻松操作

· 兼容仪器—可与使用固定角或旋转吊篮转头的标准离心机配合使用

产品推荐

*针对各 MWCO 使用四种不同的蛋白溶液

Pierce 蛋白浓缩管（使用 3K、5K、10K、30K 或 100K MWCO）以及其他供应商的 0.5 mL、6 mL、20 mL 和 100 mL 浓缩管的蛋白回收率比较。根据制造商的说明，在 Pierce 蛋白浓缩管和其他供应商的浓缩管中离心不同蛋白溶液的样本：0.5 mL (15,000 x g)、5 mL (4,000 x g)、20 mL (4,700 x g) 和 100 mL (1,200 x g)。离心样本，直至样本体积减少至 15-30 分之一以下；通过 Pierce BCA 蛋白测定试剂盒（仅 0.5 mL 浓缩管）或在 A280 吸收度下测定蛋白浓度。

步骤五：蛋白定量和检测-定量并检测您的靶蛋白

根据实验需要，可以使用多种方法来检测和分析靶蛋白。以下是用于检测和分析复杂混合物（例如裂解物和血清）中蛋白质的常见技术，以及各种方法的特点和常见要求。

总蛋白定量

总蛋白浓度测定是通过生化方法分离和分析蛋白的工作流程中的重要步骤。测定方法可以使用通过荧光计、分光光度计或酶标仪进行的比色法或荧光法检测。 根据分析类型和所分析特定蛋白样品的不同，每种蛋白检测方法都存在其局限性。选择蛋白检测方法时需要考虑的重要特性包括灵敏度（检测下限）、与样品中常见物质（例如去垢剂、还原剂、离散剂、抑制剂、盐和缓冲液）的兼容性、标准曲线线性度以及蛋白间差异。

比色法蛋白定量

可使用酶标仪或分光光度计检测比色信号。我们的比色法蛋白定量试剂有：

· BCA 测定—蛋白-铜螯合及还原铜的二次检测。

· Bradford 测定——蛋白-染料结合，可直接检测与结合染料相关的颜色变化。
 

荧光法蛋白定量

基于荧光进行蛋白定量是除比色法以外的另一选择。荧光检测法具有出色的灵敏度，所需蛋白样本较少，因而可留下较多样本以供其他实验使用。此外，读取时间并非关键因素，因此这种检测方法可轻松应用于自动化高通量分析。可使用荧光计或酶标仪检测荧光信号。

小贴士

· 任何试剂都無法做到理想蛋白测定。每种方法都有其优势和劣势。
可根据样品类型、检测时间、读数（比色法或荧光法）以及与去垢剂或还原剂的兼容性，通过交互式蛋白测定选择指南来选择产品。

· 如要了解有关不同蛋白浓度定量方法的信息，请继续阅读这篇文章：蛋白测定概述。

蛋白检测

*使用高灵敏度 HRP 底物，例如 SuperSignal West Atto 非常敏感底物

蛋白定量和检测产品

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赛默飞世尔科技（中国）有限公司