磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PEPC（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。

测定原理：

PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2 生成草酰乙酸和HPO4^2-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和NAD⁺，在 340nm 测定NADH 减少速率，计算PEPC 活性。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶试剂盒 糖代谢系列

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 取试剂二瓶一瓶，加入 6ml 试剂一和 4.2ml 蒸馏水充分混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用。

（2） 试剂三工作液的配制：将试剂三原液：试剂三稀释液=1μl:329μl 稀释，混匀，用多少配多少。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、20μl 试剂三、170μl 试剂二，混匀，立即记录 340nm处 20s 时的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

PEPC 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）PEPC 活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=643×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）PEPC 活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=1286×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

?

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1286×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶试剂盒 糖代谢系列